Apakah ujian PCR?
Ujian PCR ialah kaedah makmal yang digunakan dalam biologi molekul dan perubatan. Ujian ini digunakan untuk pengesanan langsung - dan pencirian - bahan genetik. Kaedah PCR dianggap oleh pakar sebagai mudah dilaksanakan, boleh digunakan secara universal dan teguh.
Di makmal, ujian PCR terdiri daripada dua langkah. Pada langkah pertama, bahan genetik sedia ada dikuatkan menggunakan tindak balas rantai polimerase (PCR). Ini membolehkan kesan terkecil DNA diperiksa. Ini juga sebab mengapa ujian PCR bertindak balas dengan sangat sensitif.
Dalam langkah kedua, bahan genetik dipisahkan mengikut sifatnya, "disusun" dan dengan itu dicirikan. Dengan kata lain, struktur halus DNA ditentukan.
Terdapat banyak aplikasi yang mungkin: doktor menggunakan ujian PCR, sebagai contoh, untuk memeriksa swab untuk kehadiran coronavirus, derma darah untuk HIV atau untuk menyaring bayi baru lahir untuk kemungkinan penyakit keturunan. Jangkitan bakteria – contohnya dengan patogen tuberkulosis – atau jangkitan parasit (malaria) juga boleh dijelaskan menggunakan PCR.
Mereka juga membantu untuk mensabitkan pelaku dalam perubatan forensik berdasarkan cap jari genetik mereka atau digunakan sebagai ujian paterniti.
Berapa lama ujian PCR sah?
Keputusan ujian PCR biasanya sah selama 48 jam dari masa sampel diambil.
Sejauh manakah ujian PCR boleh dipercayai?
PCR ialah kaedah pengesanan yang telah dicuba dan diuji dalam diagnostik molekul dan perubatan. Ia dianggap sebagai standard emas yang dipanggil dengan kadar ralat yang sangat rendah. Ujian ini dicirikan khususnya oleh kepekaan dan kekhususan yang sangat tinggi.
Sensitiviti bermaksud kebolehpercayaan yang mana ujian mendapati bahan genetik untuk dikesan.
Kekhususan bermaksud kepastian ujian menentukan bahawa bahan genetik yang dimaksudkan tidak terdapat dalam sampel.
Bilakah ujian PCR berfungsi untuk jangkitan Sars-CoV-2?
Sebagai peraturan, ujian PCR mengesan jangkitan korona dua hingga tiga hari sebelum dan sehingga 20 hari selepas permulaan simptom. Walaupun pada orang yang dijangkiti yang kekal tanpa gejala sepenuhnya, ujian ini berkesan dalam tetingkap masa kritikal apabila mereka boleh menjangkiti orang lain.
Dalam kes individu, pengesanan adalah mungkin 60 hari selepas permulaan simptom.
Sumber ralat yang mungkin
Kadar ralat dalam proses penyalinan DNA boleh diabaikan dalam amalan. Walaupun polimerase DNA tidak pernah bebas ralat, mereka hampir tidak memainkan peranan dalam prosedur ujian PCR.
Dalam amalan, potensi sumber ralat lebih banyak terletak pada pengumpulan sampel: oleh itu adalah penting untuk profesional perubatan terlatih menjalankan swab. Sampel air liur dan kumur mungkin boleh mengurangkan ketepatan ujian, kerana kesan pencairan berlaku di sini.
Bagaimanakah ujian PCR berfungsi?
Ujian PCR dijalankan, contohnya, oleh doktor keluarga atau di pusat ujian khas. Pertama, doktor atau profesional perubatan terlatih mengambil sampel. Sapuan biasanya diambil dari saluran pernafasan atas untuk ujian. Ini biasanya berbentuk sapuan mulut atau nasofaring.
Berkumur dengan larutan pembilas juga boleh dilakukan. Sampel darah tidak tipikal untuk pengesanan korona - tetapi digunakan secara meluas dalam pemeriksaan bayi baru lahir, contohnya.
Tidak kira jenis sampel yang diambil, bahan genetik ditemui pada swab kapas, dalam larutan bilas atau dalam titisan darah. Bahan sampel ini dihantar ke makmal, di mana ia diasingkan dan disucikan.
Ujian PCR kemudiannya dibahagikan kepada dua langkah:
- PCR: Dalam langkah ini, kuantiti bahan genetik awal diperkuatkan.
Langkah 1: PCR – “Tindak balas rantai polimerase”
“PCR” ialah langkah pertama daripada dua langkah: Di sinilah jumlah DNA permulaan yang tersedia diperkuatkan. Ini kerana bahan genetik hanya boleh dianalisis apabila ia tersedia dalam kuantiti yang mencukupi. Dalam kebanyakan kes, ini adalah DNA manusia; dalam kes ujian untuk coronavirus, ia adalah RNA virus.
Singkatan PCR bermaksud "tindak balas rantai polimerase".
Apakah yang diperlukan untuk PCR?
DNA permulaan diletakkan di dalam bekas tindak balas dengan bahan khas. Bahan genetik sedia ada berfungsi sebagai templat, yang disalin dengan kehadiran enzim tertentu (Taq polymerase) dan blok bangunan asas DNA tertentu.
Proses penyalinan berlaku dalam beberapa larian berulang (kitaran).
Secara khusus, bahan berikut ditambah bersama:
- DNA permulaan: Bahan sampel yang akan disalin.
- Blok binaan DNA asas: Ini adalah nukleobases adenine, timin, sitosin dan guanin.
- DNA polimerase: Enzim yang menghubungkan blok binaan DNA individu untuk membentuk untaian DNA yang jelas. Helai yang baru diperolehi adalah imej cermin (pelengkap) bahan permulaan asal.
- Primer: Mereka terdiri daripada 16 hingga 24 pasangan asas dan berfungsi sebagai kedudukan permulaan dan isyarat permulaan. Primer menunjukkan polimerase DNA di mana kedudukan (DNA permulaan) proses penyalinan bermula.
Bagaimanakah ujian PCR dijalankan?
Sekarang bahawa semua bahan yang diperlukan untuk PCR hadir dalam bekas tindak balas, proses penyalinan sebenar bahan genetik boleh bermula. Ini dimulakan, dikawal dan dihentikan semula semata-mata oleh suhu.
Oleh itu, bekas tindak balas dipanaskan atau disejukkan pada suhu yang berbeza satu demi satu. Ini dilakukan menggunakan peranti khas yang dikenali sebagai kitar haba. Keseluruhan tindak balas mengambil masa kira-kira satu hingga dua jam.
Langkah-langkah individu kitaran PCR ialah
- Denaturasi helai ganda DNA: Sampel dipanaskan hingga sekitar 90 darjah Celsius. Ini memisahkan helai ganda DNA asal kepada dua helai tunggal individu (pelengkap).
- Lampiran primer: Suhu diturunkan kepada sedikit di bawah 60 darjah Celsius. Ini menyebabkan primer (primer hadapan, primer terbalik) melekat pada kedudukan yang ditentukan pada helai DNA individu yang sepadan.
Selepas kitaran selesai, suhu dinaikkan semula kepada sekitar 90 darjah Celsius - kitaran bermula semula dari awal.
Kaedah PCR boleh digunakan untuk menguatkan jujukan DNA sehingga sekitar tiga pasangan kilobase (kbp). Ini sepadan dengan kira-kira 3,000 blok binaan DNA asas yang dihubungkan bersama untuk membentuk "rantai". Sebagai perbandingan: genom manusia menyimpan pelan tindakan dan maklumat untuk operasi sel dalam sekitar tiga bilion pasangan asas - genom coronavirus, sebaliknya, terdiri daripada 30,000 pasangan asas. Oleh itu, ujian PCR hanya boleh menguatkan dan memeriksa bahagian pendek daripada jumlah DNA.
Primer adalah penting
Pemilihan primer adalah penting untuk prosedur PCR. Dalam diagnostik Sars-CoV-2, sebagai contoh, beberapa primer digunakan (PCR berganda).
Oleh itu, ujian PCR Corona mencari tiga gen virus yang berbeza: Ini meningkatkan kekhususan keseluruhan kepada hampir 99.99%. Ini bermakna dengan kadar pukulan yang tinggi ini, hanya terdapat satu ujian positif palsu bagi setiap 10,000 ujian (jika sampel diambil dengan betul).
Berapa banyak bahan genetik yang disalin kini tersedia?
Mari kita anggap bahawa dua helai ganda DNA yang serupa hadir selepas kitaran pertama.
Selepas setiap kitaran, jumlah (salinan) bahan genetik berganda. Oleh itu, jumlah DNA berkembang secara eksponen.
Doktor biasanya mengulangi proses ini sekitar dua puluh hingga tiga puluh kali.
Secara kiasan, ini bermakna walaupun hanya sehelai ganda DNA tunggal ditemui dalam sampel pada mulanya, selepas dua puluh kitaran sudah ada sejuta salinan yang sama dalam bekas reaksi.
Apakah maksud nilai Ct?
Bilangan kitaran PCR yang dijalankan ditunjukkan dalam bentuk nilai Ct yang dipanggil. "Ct" berasal daripada istilah Inggeris "ambang kitaran". Nilai Ct ini memungkinkan untuk membuat pernyataan tentang jumlah bahan genetik yang sedang dicari.
Dengan nilai Ct rendah 20, terdapat banyak bahan genetik permulaan. Walau bagaimanapun, jika nilai Ct tinggi - sekitar 30 kitaran - terdapat sedikit DNA. Oleh itu, kitaran PCR mesti dijalankan lebih kerap.
Langkah 2: Elektroforesis "Isih mengikut saiz"
Sebaik sahaja bahan genetik "diperkaya" mencukupi, elektroforesis boleh dijalankan. Dalam proses ini, saintis mengeksploitasi sifat spesifik DNA: cas elektriknya.
Blok binaan DNA individu dipautkan antara satu sama lain melalui tulang belakang gula-fosfat yang bercas (negatif). Semakin panjang urutan DNA tertentu, semakin tinggi cas elektriknya.
Ini membolehkan bahan genetik diperiksa dan dicirikan. Dalam amalan, sampel yang tidak diketahui biasanya diplotkan terhadap rujukan yang diketahui pada "garis permulaan" dan dibandingkan antara satu sama lain selepas tempoh masa tertentu.
Jika "kelajuan migrasi" adalah sama untuk kedua-dua jujukan, ini bermakna pengesanan berkemungkinan besar positif: Pengesanan berkemungkinan besar positif - gen yang anda cari terkandung dalam sampel.
Kes khas koronavirus: penyediaan sampel dan RT-PCR
Pengesanan coronavirus adalah kes khas. Sars-CoV-2 adalah salah satu daripada apa yang dipanggil virus RNA. Ini bermakna bahan genetik Sars-CoV-2 hadir dalam bentuk RNA (asid ribonukleik).
RNA berbeza daripada DNA dalam beberapa aspek sahaja. Antara lain, ia hadir sebagai satu helai dan berasaskan ribosa gula dan bukannya 2'-deoksiribosa. Nukleobase timin juga digantikan oleh urasil sebagai asas keempat.
RNA virus ini mesti "ditranskripsikan" ke dalam DNA sebelum ujian PCR biasa. Proses ini dipanggil transkripsi terbalik (RT) - oleh itu istilah RT-PCR. Satu helai cDNA (“DNA pelengkap”) diperolehi sebagai sebahagian daripada proses ini. Dalam langkah selanjutnya, helai tunggal cDNA ditambah dengan helai DNA imej cermin kedua.
Berapa lama masa yang diambil untuk mendapatkan hasilnya?
Sebaik sahaja sampel telah dihantar ke makmal, anda biasanya akan menerima keputusan dalam masa satu atau dua hari bekerja. Di pusat ujian, yang sering memeriksa sampel secara langsung di tapak, ia juga boleh mengambil masa beberapa jam sahaja. Jangka masa bergantung pada pusat ujian masing-masing dan logistiknya.
Walaupun proses kerja yang kompleks, makmal moden mampu menjalankan ujian PCR dengan daya pemprosesan yang tinggi. Peranti automatik khas membantu menjalankan ujian.
Walau bagaimanapun, ujian PCR dianggap sebagai kaedah pengesanan yang agak "lambat" tetapi lebih dipercayai.
Apa yang berlaku jika hasilnya positif?
Jika sampel diambil dengan betul, ujian PCR positif bermakna terdapat kebarangkalian yang sangat tinggi bahawa orang yang diuji dijangkiti Sars-CoV-2.
Sekiranya anda telah disahkan dijangkiti coronavirus menggunakan ujian PCR, jabatan kesihatan awam akan menerima pemberitahuan keputusan ujian positif daripada makmal berkaitan. Dalam kes sedemikian, jabatan kesihatan awam akan mengarahkan pengasingan atau kuarantin.
Adakah saya secara automatik menular jika saya positif PCR?
Biasanya ya. Tetapi tidak selalu. Keputusan ujian PCR hendaklah sentiasa ditafsirkan dalam konteks. Ujian positif bermakna pertama sekali anda membawa bahan virus.
Ujian antibodi tambahan kadangkala berguna
Dalam kes sedemikian, ujian antibodi memberikan kepastian yang mengesahkan kesahihan ujian PCR. Adalah lebih baik untuk membincangkan perkara ini dengan doktor anda. Mereka boleh membantu anda mentafsir keputusan ujian PCR dengan betul.
Apa yang perlu dilakukan jika hasilnya negatif?
Keputusan ujian PCR negatif berkemungkinan besar bermakna anda tidak mempunyai Covid-19 pada masa sampel diambil dan oleh itu tidak berjangkit pada masa ini. Walau bagaimanapun, anda mungkin berada dalam fasa jangkitan awal.
Jangkitan korona biasanya hanya boleh dikesan dari hari kedua atau ketiga selepas jangkitan. Oleh itu, hasilnya bukan pas percuma. Oleh itu, anda harus terus mematuhi peraturan penjarakan sosial dan kebersihan serta terus memakai topeng FFP2 – untuk perlindungan anda sendiri dan orang lain.
Ujian PCR untuk kanak-kanak
Ujian PCR untuk kanak-kanak tidak berbeza dengan ujian PCR untuk orang dewasa. Kedua-dua pengumpulan sampel dan tafsiran keputusan terpakai kepada kanak-kanak dan juga orang dewasa.
Apakah risiko ujian PCR?
Ujian PCR tidak melibatkan sebarang risiko fizikal. Hanya pengumpulan sampel melalui swab nasofaring dianggap oleh sesetengah orang sebagai mengganggu atau tidak menyenangkan.
Apakah kos ujian PCR?
Sila ambil perhatian: Jika anda telah menguji diri anda di rumah dan menerima keputusan positif, anda harus membuat temu janji dengan doktor anda dengan segera melalui telefon. Doktor anda akan membincangkan langkah seterusnya dengan anda melalui telefon.
Sebagai alternatif, sebaiknya hubungi 116 117 untuk mendaftar ujian PCR. Sebaik-baiknya, anda perlu tinggal di rumah sehingga ujian pengesahan untuk melindungi diri anda dan orang lain.
